Creado por el Laboratorio Castro.
1. Recolección de muestras de agua
1.1 Materiales
- Generador Honda EU10i
- Alargador
- Electrobomba con rodete periférico
- Malla de 50 µm (Sefar)
- Manguera para bomba eléctrica (FLEXHOSE PVC FIBER REINFORCED 70 PS)
- Cuerda (~60 m)
- Bidones de 35 L
- Sensor Hobo Onset Temp/Light
- Amarracables (pequeños y medianos)
- Guantes
- Botellas J 125 mL
- Multiparámetro (HANNA HI9829)
- Caja con diversas herramientas
- Jarro de 1 L
- Paños de limpieza
- Cinta americana (DuckTape)
- Jeringa 50 mL
1.2 Procedimiento
El día anterior al muestreo, lavar todo el material (bidones y jarro) con agua corriente (1 vez), hipoclorito de sodio al 1% (1 vez) y agua miliQ (3 veces).
Previo a la extracción de agua, se deben amarrar los sensores Hobo a la electrobomba utilizando y ajustando los amarracables para evitar movimiento del sensor. Asegurarse de que la manguera esté bien apretada a la entrada de la bomba para evitar pérdidas o colapso de la manguera; en el extremo de salida se acopla la malla de 50 µm.
Sumergir la electrobomba en la columna de agua sin que esté encendida. Fijar con cuerdas si es necesario para evitar movimiento pendular. Antes de encender el generador Honda EU10i, asegurarse de que la palanca lateral se encuentre hacia atrás (mayor potencia), el botón trasero indique la figura del conejo, y la perilla esté en ON. Previo al llenado de bidones, esperar 1 minuto para ambientar la manguera con el agua del entorno. Como recomendación, el extremo de salida de la manguera puede fijarse con un nudo de anclaje hacia el arco de la plataforma.
Antes de comenzar a llenar los bidones, ambientar la manguera y los bidones 3 veces con el agua que se muestreará. Luego de extraer 35 L de agua, recolectar agua con el jarro de 1 L para medir parámetros fisicoquímicos con el multiparámetro (HANNA HI9829). Adicionalmente, recolectar agua en jeringas de 50 mL para ser utilizadas en el procedimiento de filtración de nutrientes inorgánicos (ver punto 2).
Una vez recolectada la muestra, apagar el generador y desmontar la electrobomba, evitando que bombee aire (lo que interferiría en su correcto funcionamiento).
Trasladar inmediatamente las muestras recolectadas a la cámara fría (4 °C) hasta el comienzo de la filtración.
Considerar el uso de indumentaria impermeable, dado que es imposible no terminar mojado.
2. Filtración de las muestras
2.1 Materiales
- Bomba peristáltica MasterFlex
- Manguera MasterFlex 06509-25 Tygon (transparente)
- Manguera MasterFlex 6424-25 (blanca)
- Cabezales y fierritos (×4)
- DNA/RNA Shield
- Tubos Falcon 15 mL
- Tubos Falcon 50 mL
- Filtros 0.22 µm (pirinolas)
- Filtros GFF 25 mm
- Filtros GFF 25 mm muflados
- Filtros Sterivex PES (0.22 µm)
- Filtros de membrana Isopore Type 3.0 µm
- Parafilm
- Micropipeta P1000
- Caja de puntas P1000
- Marcador permanente (×3)
- Pinzas planas
- Portafiltro Swinnex 25 mm
- Portafiltro Swinnex 47 mm
- Pipetas plásticas 20 mL
- Amarracables
- Cloro 1%
- Etanol 70%
- Agua miliQ
2.2 Filtración para determinación de clorofila y nutrientes orgánicos e inorgánicos
La filtración de clorofila y nutrientes orgánicos se realiza con los portafiltros Swinnex de 25 mm, considerando 1 L de muestra por filtración y dos líneas con portafiltros. Conectar la manguera MasterFlex 06509-25 Tygon (transparente) en la parte anterior del portafiltro (hacia la muestra) y la manguera MasterFlex 6424-25 (blanca) en la parte posterior. Luego de armar las líneas, asegurar las mangueras en la bomba peristáltica sin apretarlas en exceso. Colocar con pinzas un filtro GFF 25 mm para la línea de clorofila y un filtro GFF 25 mm muflado para la línea de nutrientes orgánicos. Al momento de filtrar, se recomienda aplicar 130 rpm si la muestra no presenta turbidez significativa; de lo contrario, reducir la velocidad hasta 60 rpm.
Al finalizar, doblar cada filtro hacia adentro en dos, envolver en papel aluminio y guardar en tubos de 15 o 50 mL a −20 °C hasta su procesamiento en el laboratorio. Lavar inmediatamente las mangueras y el portafiltro Swinnex de 25 mm con 1 L de agua potable, 1 L de cloro al 1% y 1 L de agua miliQ.
Para determinar la concentración de nutrientes inorgánicos, filtrar 100 mL de muestra utilizando una jeringa de 50 mL. Ambientar 3 veces la jeringa y las botellas J antes de comenzar. Acoplar el filtro de 0.22 µm (pirinola) y filtrar hasta completar 100 mL en las botellas J. Guardar las botellas J a −20 °C para análisis posterior.
2.3 Filtración para extracción de material genético
La filtración para extracción de material genético se realiza con los portafiltros Swinnex de 47 mm. Para aumentar el largo de la manguera de entrada (transparente), acoplar una pipeta de 10 mL que vaya directamente a la muestra. Colocar el filtro de membrana Isopore Type 3 µm en el portafiltro Swinnex de 47 mm. Para finalizar el ensamblaje de la línea, unir el filtro Sterivex 0.22 µm a la boca de la manguera de salida (blanca). Ajustar las conexiones de las mangueras hacia y desde los filtros con amarracables para evitar pérdida de volumen.
- Para filtraciones con objetivo de extracción de ADN, no superar los 120 rpm; si la muestra presenta turbidez, reducir hasta 60 rpm.
- Para filtraciones con objetivo de extracción de ARN, no superar los 80 rpm; reducir hasta 50 rpm si la muestra está turbia.
El volumen de filtración por muestra es de 5 a 10 L, o hasta la saturación del filtro Sterivex 0.22 µm. Monitorear continuamente las mangueras para evitar fugas.
Una vez filtrado el volumen o saturado el filtro Sterivex, detener la bomba peristáltica y desacoplar el portafiltro Swinnex de 47 mm para retirar el filtro de membrana de 3 µm. Doblarlo hacia adentro dos veces y guardarlo en un tubo Falcon de 15 mL:
- Si se extraerá ARN: añadir 500 µL de DNA/RNA Shield al tubo.
- Si se extraerá ADN: guardar el filtro sin añadir nada.
Desacoplar el filtro Sterivex de la manguera de salida y descartar el líquido interior sacudiéndolo suavemente. Sellar la salida con Parafilm:
- Si se extraerá ARN: añadir 500 µL de DNA/RNA Shield y sellar la entrada con Parafilm.
- Si se extraerá ADN: sellar la entrada con Parafilm sin añadir nada.
Almacenar los filtros (3 µm y Sterivex 0.22 µm) a −20 °C hasta su procesamiento en el laboratorio.
Lavar las líneas inmediatamente tras cada filtración: 1 L de agua potable, 1 L de cloro al 1% y 1 L de agua miliQ, descartando todo el líquido interior de las mangueras. Rociar con etanol al 70% el exterior de las mangueras entre cada muestra para evitar contaminación cruzada.