Toma de muestra de biofilm subgingival en pacientes con periodontitis

Extracción de ADN desde Muestras de Biofilm Subgingival/Submucoso (Periodontitis y Periimplantitis)

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Creado por el Laboratorio Castro.

Contexto clínico

La periodontitis y la periimplantitis son enfermedades inflamatorias crónicas de origen microbiano que afectan los tejidos de soporte dentario y periimplantario, respectivamente. Ambas condiciones se caracterizan por una comunidad bacteriana subgingival/submucosa disbiótica, enriquecida con patógenos periodontales como Porphyromonas gingivalis, Treponema denticola y Tannerella forsythia (complejo rojo), entre otras especies anaerobias [Paster et al., 2001; Yu et al., 2024]. El análisis del microbioma mediante secuenciación del gen ARNr 16S (regiones hipervariables V3-V4) permite caracterizar con alta resolución las comunidades microbianas asociadas a la enfermedad [Arredondo et al., 2023; Szafrański et al., 2014].

La selección del método de extracción de ADN es crítica: protocolos que incorporan lisis mecánica con beads de vidrio mejoran significativamente la recuperación de especies de difícil lisis, como Gram-positivas y microorganismos con pared celular robusta [Abusleme et al., 2014; Teng et al., 2018]. La combinación de lisis mecánica (bead beating), lisis enzimática (lisozima + proteinasa K) y purificación por columna de sílica es actualmente el enfoque recomendado para maximizar el rendimiento y la diversidad representada en muestras de placa subgingival [Vesty et al., 2017; Santamaria et al., 2025].

1. Toma de muestra

1.1 Pacientes

Las muestras se obtienen de pacientes con diagnóstico confirmado de periodontitis o periimplantitis según los criterios del Taller Mundial de Clasificación 2017 (Tonetti et al., 2018). Para periimplantitis, se selecciona el sitio con mayor profundidad de sondaje (≥ 5 mm con sangrado al sondaje y pérdida ósea radiográfica).

1.2 Materiales para toma de muestra

  • Curetas mini Gracey estériles (#11–12)
  • Tubos Eppendorf de 1.5 mL (estériles)
  • Buffer TE 1X (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8.0)
  • Guantes de nitrilo sin polvo
  • Mascarilla y antiparras de protección
  • Algodones estériles para aislamiento relativo
  • Sonda periodontal calibrada
  • Jeringa de irrigación con suero fisiológico estéril

1.3 Procedimiento de toma de muestra

  1. Realizar remoción de placa suprамucosa con algodones estériles antes de la toma de muestra para evitar contaminación cruzada.
  2. Identificar el sitio de mayor profundidad de sondaje en cada implante con periimplantitis (o diente con periodontitis).
  3. Con la cureta mini Gracey estéril (#11–12), raspar suavemente la pared del bolsillo para recolectar el biofilm submucoso/subgingival.
  4. Depositar inmediatamente la muestra en un tubo Eppendorf de 1.5 mL conteniendo 300 µL de buffer TE 1X.
  5. Mantener las muestras en frío (hielo) durante el procedimiento clínico.
  6. Almacenar a −80 °C hasta su procesamiento.

Nota: La elección de curetas sobre puntas de papel mejora la diversidad microbiana recuperada y reduce el riesgo de contaminación con ADN exógeno [Beyer et al., 2017].

2. Extracción de ADN

2.1 Materiales

Reactivos:

  • Buffer de lisis (ver sección 2.4 para preparación)
  • Glass beads (beads de vidrio, 1 mm de diámetro)
  • Lisozima 100 mg/mL (Thermo Fisher, cat. 89833)
  • Proteinasa K 200 µg/mL
  • Kit de purificación Zymo Research (Zymo Bacterial/Fungal DNA Mini Prep™ o equivalente):
    • Columnas de sílica con tubo colector
    • DNA Pre-Wash Buffer
    • DNA Wash Buffer
    • DNA Elution Buffer
  • Agua libre de nucleasas

Equipamiento:

  • Vórtex
  • Termobloque con agitación (o baño de agua)
  • Centrífuga de microtubo (capacidad ≥ 10,000 × g)
  • Qubit 4 Fluorometer® con reactivos Qubit dsDNA HS Assay
  • Sistema de electroforesis capilar (para evaluación de integridad)
  • Micropipetas (p20, p200, p1000)
  • Puntas de micropipeta con filtro
  • Guantes de nitrilo sin polvo
  • Gradilla para tubos Eppendorf
  • Hielo

2.2 Procedimiento de extracción

Paso 1 — Lisis mecánica:

  1. Retirar los tubos del almacenamiento a −80 °C y descongelar en hielo.
  2. Agregar 500 µL de buffer de lisis a cada tubo.
  3. Incorporar glass beads (1 mm de diámetro) hasta un volumen aproximado de 1 mL por tubo.
  4. Agitar en vórtex a máxima velocidad durante 20 minutos a temperatura ambiente para promover la lisis mecánica.

La lisis mecánica con beads de vidrio es el único método que garantiza la recuperación de todas las especies bacterianas, incluyendo las de difícil lisis [Abusleme et al., 2014]. La combinación bead-beating + enzimas mejora la representación de la diversidad microbiana frente a métodos exclusivamente enzimáticos [Teng et al., 2018].

Paso 2 — Lisis enzimática (lisozima):

  1. Agregar 60 µL de lisozima (100 mg/mL) a cada tubo.
  2. Incubar a 40 °C durante 1 hora en termobloque.
  3. Al finalizar la incubación, agitar brevemente en vórtex para resuspender el material celular lisado.

Paso 3 — Lisis proteolítica (proteinasa K):

  1. Agregar 10 µL de proteinasa K (200 µg/mL) a cada tubo.
  2. Incubar a 56 °C durante 1 hora para completar la lisis enzimática y liberar el material genético.

Paso 4 — Purificación con columna de sílica (Zymo Research):

  1. Transferir todo el contenido del tubo a la columna de sílica ensamblada en su tubo colector.
  2. Centrifugar a 10,000 × g durante 1 minuto 30 segundos.
  3. Desechar el tubo colector. Trasladar la columna a un nuevo tubo colector.
  4. Agregar 200 µL de DNA Pre-Wash Buffer.
  5. Centrifugar a 10,000 × g durante 1 minuto 30 segundos. Desechar el eluido.
  6. Agregar 500 µL de DNA Wash Buffer.
  7. Centrifugar a 10,000 × g durante 1 minuto 30 segundos. Desechar el eluido.
  8. Transferir la columna a un tubo Eppendorf limpio de 1.5 mL.
  9. Agregar 40 µL de DNA Elution Buffer directamente sobre la membrana de la columna.
  10. Incubar a temperatura ambiente durante 2–5 minutos.
  11. Centrifugar a 10,000 × g durante 1 minuto para eluir el ADN.

2.3 Cuantificación y evaluación de calidad

  • Concentración: Cuantificar el ADN eluido mediante Qubit 4 Fluorometer® usando el kit Qubit dsDNA HS Assay Kit.
  • Integridad: Evaluar mediante electroforesis capilar (e.g., Agilent TapeStation o BioAnalyzer).
  • Almacenamiento: Conservar el ADN extraído a −20 °C para aplicaciones futuras.

Se recomienda alcanzar una concentración mínima de 1 ng/µL para asegurar la calidad del input para la construcción de librerías de secuenciación 16S.

2.4 Preparación del buffer de lisis

En un tubo o frasco estéril, mezclar:

ComponenteConcentración final
Xantogenato (Sigma 254770)1% p/v
Acetato de amonio4 M
Tris-HCl pH 7.410% v/v
EDTA disódico 0.45 M pH 83.6% v/v

Completar con agua libre de nucleasas hasta el volumen final deseado. Cubrir con papel aluminio y almacenar a 4 °C por hasta 7 días.

3. Aplicaciones downstream

El ADN extraído mediante este protocolo es adecuado para:

  • Secuenciación de amplicones 16S rRNA (regiones hipervariables V3-V4 en plataforma Illumina MiSeq) [Vesty et al., 2017; Arredondo et al., 2023]
  • PCR cuantitativa (qPCR) para cuantificación de patógenos periodontales específicos (P. gingivalis, T. denticola, T. forsythia, F. nucleatum)
  • Secuenciación de longitud completa del gen 16S (plataformas PacBio SMRT) para mayor resolución taxonómica a nivel de especie [Buetas et al., 2024; Yu et al., 2024]
  • Metagenómica shotgun (con input mínimo adicional)

4. Consideraciones adicionales

  • Medio de almacenamiento: El buffer TE 1X a −80 °C preserva adecuadamente la integridad del ADN bacteriano en muestras de biofilm subgingival. Alternativas como la solución de Bead (buffer de preservación) son compatibles con kits de extracción con y sin bead-beating [Zhou et al., 2019].
  • Contaminación: Trabajar en área limpia, preferentemente cerca de mechero o en gabinete de bioseguridad. Incluir controles negativos de extracción en cada lote.
  • Número de muestras: Procesar muestras por lotes para estandarizar tiempos de incubación y centrifugación.

5. Referencias

  • Abusleme, L. et al. (2014). Influence of DNA extraction on oral microbial profiles obtained via 16S rRNA gene sequencing. Journal of Oral Microbiology, 6, 23990.
  • Arredondo, A. et al. (2023). Comparative 16S rRNA gene sequencing study of subgingival microbiota of healthy subjects and patients with periodontitis from four different countries. Journal of Clinical Periodontology, 50(3), 346–358.
  • Beyer, K. et al. (2017). Comparison of paperpoint and curette sampling of subgingival microbiome composition as analyzed by 16S rRNA gene amplicon sequencing. Journal of Oral Microbiology, 9(1), 1330097.
  • Buetas, E. et al. (2024). Full-length 16S rRNA gene sequencing by PacBio improves taxonomic resolution in human microbiome samples. BMC Genomics, 25, 76.
  • Lim, Y. et al. (2017). The oral microbiome in oral cancer. PloS One, 12(4), e0175439.
  • Paster, B.J. et al. (2001). Bacterial diversity in human subgingival plaque. Journal of Bacteriology, 183(12), 3770–3783.
  • Santamaria, P. et al. (2025). Impact of optimised sample preparation method on DNA recovery from subgingival plaque in a population with periodontitis. Archives of Oral Biology.
  • Szafrański, S.P. et al. (2014). High-resolution taxonomic profiling of the subgingival microbiome for biomarker discovery and periodontitis diagnosis. Applied and Environmental Microbiology, 81(4), 1047–1058.
  • Teng, F. et al. (2018). Impact of DNA extraction method and targeted 16S-rRNA hypervariable region on oral microbiota profiling. Scientific Reports, 8, 16321.
  • Vesty, A. et al. (2017). Evaluating the impact of DNA extraction method on the representation of human oral bacterial and fungal communities. PLoS ONE, 12(5), e0169877.
  • Yu, P.S. et al. (2024). Microbiome of periodontitis and peri-implantitis before and after therapy: Long-read 16S rRNA gene amplicon sequencing. Journal of Periodontal Research, 59(3), 541–552.
  • Zhou, X. et al. (2019). Storage media and not extraction method has the biggest impact on recovery of bacteria from the oral microbiome. Scientific Reports, 9, 4740.
Others